A substituição de animais em laboratórios (parte 1)

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laboratoryO uso de animais em ciências remonta à Grécia antiga e aos primeiros experimentos médicos. Durante séculos, médicos e pesquisadores utilizaram animais para conhecer melhor o funcionamento de órgãos e sistemas do corpo humano e aprimorar suas habilidades cirúrgicas. A ascensão da ciência biomédica moderna no século XIX causou o aumento do número de animais utilizados em experiências, bem como da resistência à vivissecção. Embora a opinião sobre o grau de sofrimento experimentado por animais variasse entre os cientistas e o público, a maioria dos cientistas ficou unida na crença de que experiências em animais eram fundamentais para expansão do conhecimento.

Após o nascimento da indústria química sintética no final de 1800, o campo da toxicologia cresceu em resposta à necessidade de se compreender como dezenas de milhares de novas substâncias poderiam afetar a saúde dos trabalhadores e consumidores envolvidos na sua produção e utilização. O uso de animais vivos para estudar os efeitos adversos potenciais de novos medicamentos, aditivos alimentares, pesticidas e outras substâncias passou a ter maior consistência durante a década de 1920, quando o farmacologista J.W. Trevan propôs a “dose letal para 50 por cento” (DL50) para a determinação da dose única de uma substância química que mataria metade dos animais expostos a ele. A ideia de um índice de toxicidade comparativa oferecia apelo imediato às agências reguladoras dos governos – tanto que as variantes do ensaio DL50 continuam sendo os testes em animais mais prevalentes até hoje.

A publicação do livro “Principles of Human Experimental Technique” pelos pesquisadores William Russel e Rex Burch em 1959 iniciou o movimento de proteção aos animais usados em experimentação, e representou um marco na discussão sobre a utilização de animais para a avaliação de toxicidade. A partir deste, ficou estabelecido o princípio dos 3R´s que, nas décadas seguintes à sua publicação, possibilitou a união dos pesquisadores e defensores do bem-estar animal em torno de um objetivo comum: encontrar alternativas cientificamente válidas para os testes feitos em animais. No avanço da ciência nos anos posteriores, ficam mais claras as diferenças metabólicas e de respostas que controlam a homeostasia tecidual em animais e humanos e fica evidente a necessidade de modelos in vitro mais apropriados.

Devido à evolução técnico-científica, na década de 80 iniciou-se o desenvolvimento de modelos experimentais alternativos para a área cosmética, em substituição ao uso de animais de laboratório. Algumas metodologias foram desenvolvidas, inicialmente, para responder corretamente as necessidades de pesquisa em farmacologia, onde se sabe que o comportamento animal pode ser diferente do humano. Os métodos alternativos também foram contemplados para a avaliação de efeitos toxicológicos. Alguns destes métodos vêm sendo utilizados desde tempos remotos, em particular na área da mutagenicidade onde numerosos testes foram desenvolvidos, validados e integrados nas diretivas internacionais tais como a L’Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE).

Também foram utilizados com sucesso para a demonstração de mecanismo de ação específico, sugerindo serem úteis e preditivos no que se refere a sistemas biológicos simples, como por exemplo, nos estudos feitos em microorganismos, células, tecidos e/ou órgãos de animais ou humanos. A dificuldade no emprego de tais métodos alternativos, hoje, reside na avaliação da reatividade de sistemas mais complexos o que é, na prática, o caso da avaliação de risco toxicológico. É necessário o acesso a uma bateria de testes que sejam complementares, de maneira que o conjunto destes ofereça um resultado com os mesmos níveis científicos e de informação, em relação aos obtidos, anteriormente, com os modelos em animais. Tais modelos alternativos devem ser, portanto, validados, de acordo com os procedimentos internacionais na área de aplicação para que sejam reconhecidos pelo meio científico e pelos órgãos regulamentadores.

Vários esforços tem sido efetuados para a diminuição do uso e do sofrimento de animais. Em 1984, o governo britânico concedeu fundos para o desenvolvimento de métodos alternativos ao Fund for Replacement of Animal Medical Experiments (FRAME) que, desde 1983, edita uma revista internacional intitulada Alternatives to Laboratory Animals (ATLA). Em 1994, foi inaugurado o European Committee for Validation of Alternative Methods (ECVAM) – instituição da Comissão Européia encarregada de promover e validar técnicas e metodologias destinadas à substituição dos ensaios em animais. Algumas instituições, como Cosmetic, Toiletries and Frangrance Association (CTFA), Interagency Regulatory Alternatives Group (IRAG), Food and Drug Administration (FDA) e Alternatives to Animal Testing, John Hopkins University, Baltimore – USA, são referências para acelerar a padronização e a harmonização de metodologias in vitro.

A ideia de ensaios alternativos é muito mais abrangente do que a substituição do uso de animais, incluindo também a questão da redução e refinamento na utilização dos mesmos. Este princípio está baseado no conceito dos 3R’s (Three R’s), o qual foi definido por William Russell e Rex Burch, em 1959, no livro Principles of Human Experimental Technique. Os 3 R’s que representam o refinamento, redução e substituição (Refine, Reduction e Replacement) têm como estratégia, uma pesquisa racional minimizando o uso de animais e o seu sofrimento, sem comprometer a qualidade do trabalho científico que está sendo executado visualizando, futuramente, a total substituição de animais por modelos experimentais alternativos.

O termo refinamento significa a modificação de algum procedimento operacional com animais, objetivando minimizar a diminuição da dor e o estresse. A experiência da dor e do estresse tem, como resultado, mudanças psicológicas que aumentam a variabilidade experimental dos resultados. O interesse dos cientistas é assegurar que as condições ambientais para os animais sejam as melhores possíveis. Os testes considerados menos invasivos podem ser utilizados para diminuir a angústia causada durante o estudo. Além disto, é importante que toda a equipe envolvida seja bem treinada e competente no que se refere a correta atitude em relação aos animais.

A concepção de redução como alternativa estratégica, resulta em menor número de animais sendo utilizados para obter a mesma informação, ou maximização da informação obtida por animal. Existem várias possibilidades para redução do uso de animais. Alguns laboratórios alertam todos os pesquisadores quando as pesquisas levam o animal a morte. Assim, é dado preferência para pesquisas que utilizem os vários órgãos de um mesmo animal, associadas aos dados apropriados e princípios estatísticos. Em outros casos, pode-se executar um estudo piloto indicando se o procedimento será apropriado para um estudo maior. Para tanto é possível a utilização de estudos preliminares in vitro, os quais podem indicar novos caminhos, utilizando técnicas não invasivas.

Um sistema experimental que esteja vinculado à totalidade da condição de vida animal, pode ser considerado como substituto alternativo. Pode-se citar a proposta de obtenção de células, tecidos ou organismos para subseqüentes estudos in vitro ao invés da matança de animais. Portanto, verifica-se que alguns métodos alternativos, podem ser utilizados na total substituição em estudos animais e outros, podem complementar dados, auxiliando na redução de utilização de animais empregados em todo projeto. O maior ímpeto de desenvolvimento para testes alternativos tem sido determinado pela indústria farmacêutica. Este investimento tem conduzido para o desenvolvimento adequado da triagem dos componentes para avaliação de potencial toxicológico e eficácia. A utilização da informática, as informações sobre matérias-primas, técnicas físico-químicas, cultura de células, tecidos e órgãos, contribuem para um banco de informações, evitando a duplicação desnecessária de trabalho com animais.

Os riscos a serem avaliados para ingredientes e produtos cosméticos são do tipo irritativo, alergênico e sistêmico, este último, essencialmente por meio de sua absorção oral ou permeação. Vários testes desenvolvidos foram aceitos e utilizados na avaliação do risco irritativo. Entretanto, nem todos estão validados até o presente momento, uma vez que os resultados obtidos foram divergentes entre os laboratórios. Baseando-se num banco de dados consistente qualquer pesquisador treinado pode, no entanto, interpretar os resultados obtidos para a comparação entre produtos da mesma categoria. Esses modelos citados, a seguir, só podem ser contemplados como modelos experimentais de “triagem”, ou seja, de caráter preliminar.

Através de um conjunto de métodos in vitro (HET-CAM, BCOP, Citotoxicidade pela difusão em gel de agarose, Citotoxicidade pelo método do Vermelho Neutro, Citotoxicidade pelo método do MTT, RBC), agrupam-se informações que oferecem subsídios para garantir a segurança do produto a nível ocular. Como há mais de um mecanismo de irritação ocular apenas um ensaio in vitro não é suficiente para uma completa avaliação. O ideal é obtermos dados relacionados à vascularização (Het-Cam), opacidade / permeabilização (BCOP) e citotoxicidade (MTT, RBC).

A utilização do teste de corrosividade com modelo de pele reconstituída já é considerado uma metodologia validada. No entanto, este modelo é mais utilizado em ensaios com ingredientes mas, não atende às necessidades de avaliação de produtos acabados. O teste de fototoxicidade, através da metodologia (3T3 NRU), é definido como uma resposta tóxica clara depois da primeira exposição da célula com agentes químicos, e posterior exposição à irradiação. No que se refere à avaliação do risco alergênico e fotoalergênico ainda não existem testes in vitro, dispondo-se apenas de um teste, que embora não seja considerado como metodologia in vitro, contribui na redução do número de animais de laboratório. Na outra parte desse artigo seguem alguns testes.

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