
A NBR ISO 21527-1 de 03/2021 – Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal – Método horizontal para enumeração de leveduras e bolores – Parte 1: Técnica de contagem de colônias em produtos com atividade de água superior a 0,95 especifica um método horizontal para a enumeração de leveduras e bolores viáveis em produtos destinados ao consumo humano ou animal com atividade de água superior a 0,95 [ovos, carnes, laticínios (exceto leite em pó), frutas, vegetais, pastas frescas etc.], por meio da técnica de contagem de colônias a 25 °C ± 1 °C.
Essa parte não permite a enumeração de esporos de fungos. Nem a identificação da microbiota de fungos nem o exame de alimentos para micotoxinas estão dentro do escopo desta parte. O método especificado nesta parte da não é adequado para a enumeração de fungos resistentes ao calor, como Byssochlamys fulva ou Byssochlamys nivea, em frutas e vegetais enlatados ou engarrafados.
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Devido à grande variedade de alimentos para consumo humano e animal, as aplicações do método horizontal especificado na NBR ISO 21527 (todas as partes) podem não ser apropriadas para certos produtos. Neste caso, podem ser utilizados métodos diferentes, específicos para estes produtos, se for absolutamente necessário por razões técnicas justificadas.
No entanto, devem ser feitas todas as tentativas para aplicar o método horizontal, conforme especificado na NBR ISO 21527 (todas as partes), tanto quanto possível. Quando ocorrer a próxima revisão da NBR ISO 21527 (todas as partes), serão levadas em consideração todas as informações então disponíveis sobre a extensão em que o método horizontal foi seguido e as razões para desvios deste método, no caso de produtos específicos.
A harmonização dos métodos de ensaio pode não ser imediata e, para certos grupos de produtos, podem já existir normas internacionais e/ou normas nacionais que não estejam em conformidade com o método horizontal especificado na NBR ISO 21527 (todas as partes). Espera-se que, quando estas normas forem analisadas criticamente, elas sejam alteradas para atender à NBR ISO 21527 (todas as partes), de modo que, eventualmente, os únicos desvios remanescentes deste método horizontal sejam aqueles necessários por razões técnicas bem estabelecidas.
Dessa forma, pode-se definir a levedura como um microrganismo aeróbio mesofílico que, a 25 °C, desenvolve colônias redondas foscas ou brilhantes, geralmente com um contorno regular e uma aparência mais ou menos convexa, na superfície do meio de ágar micológico, nas condições descritas nesta parte da NBR ISO 21527. As leveduras no interior de um meio, ao invés de sobre um meio, desenvolvem colônias arredondadas lenticulares.
O bolor é um microrganismo filamentoso aeróbio mesofílico que, na superfície do meio de ágar micológico nas condições descritas nesta parte da NBR ISO 21527, geralmente desenvolve espalhamento plano ou felpudo/algodonoso de propágulos/germe ou colônias, frequentemente com frutificação colorida ou estruturas de esporos. Bolores no interior de um meio, ao invés de sobre um meio, podem desenvolver colônias arredondadas lenticulares.
As placas inoculadas na superfície são preparadas usando um meio de cultura seletivo especificado. Dependendo do número esperado de colônias, utiliza-se uma quantidade especificada da amostra (se o produto for líquido), ou de uma suspensão inicial (no caso de outros produtos), ou diluições decimais da amostra/suspensão. Placas adicionais podem ser preparadas nas mesmas condições, usando diluições decimais da amostra de ensaio ou da suspensão inicial.
As placas são então incubadas aerobicamente a 25 °C ± 1 °C, durante 5 d. Se necessário, as placas de ágar são deixadas à luz natural difusa por 1 d a 2 d. Colônias/propágulos são então contados e, se requerido (para distinguir colônias de leveduras de colônias bacterianas), a identidade de quaisquer colônias duvidosas é confirmada por exame com uma lupa binocular ou microscópio.
O número de leveduras e bolores por grama ou por mililitro de amostra é calculado a partir do número de colônias/propágulos/germes obtidos em placas escolhidas em níveis de diluição, produzindo colônias contáveis. Bolores e leveduras são contados separadamente, se necessário. Para a prática laboratorial atual, ver ISO 6887 (all parts) e ISO 8261.
Para o diluente, ver ISO 6887 (all parts), ISO 8261 e a norma internacional específica que trate do produto em questão. É possível adicionar agentes tensoativos como monooleato de sorbitano polioxietileno de sódio 1 [0,05 % (concentração mássica)] aos diluentes, para reduzir a aglomeração de esporos de fungos e conídios. Exceto para a preparação específica da amostra de ensaio, é recomendado o uso de caldo de peptona a 0,1 % (concentração de mássica) como diluente.
A composição do caldo de peptona a 0,1 % (concentração de mássica) é para a digestão enzimática de tecidos animais ou vegetais 1,0 g, Água 1.000 mL. Para a preparação do caldo de peptona a 0,1% (concentração de mássica), dissolver os componentes na água, aquecendo, se necessário. Se necessário, ajustar o pH para que, após a esterilização, ele esteja a 7,0 ± 0,2, a 25 °C.
O tween 80 é um exemplo de um produto adequado comercialmente disponível. Esta informação é dada para facilitar aos usuários deste documento e não constitui um endosso por parte da ABNT ao produto citado. Suspender todos os ingredientes, exceto o cloranfenicol, na água e ferver para dissolver completamente. Se necessário, ajustar o pH (6.4) para que, após a esterilização, ele esteja a 5,6 ± 0,2, a 25 °C.
Adicionar 10 mL de uma solução de cloranfenicol a 1% (concentração de mássica) em etanol e misturar. Verter o meio em quantidades adequadas dentro de recipientes (6.5) com capacidade pertinente. Esterilizar em autoclave a 121 °C, durante 15 min. Imediatamente, resfriar o meio em banho-maria (6.3) mantido à temperatura de 44 °C a 47 °C. Resfriar para abaixo de 50 °C e verter quantidades de 15 mL em placas de Petri estéreis (6.6).
Deixar o meio solidificar e secar, se necessário, a superfície das placas, conforme descrito nas NBR ISO 7218 e ISO/TS 11133 (all parts). Usar imediatamente ou armazenar no escuro, de acordo com a ISO/TS 11133 (all parts), até que seja requerido. Evitar a exposição do meio à luz, uma vez que produtos de degradação citotóxicos podem subestimar a microbiota fungica nas amostras. Onde o supercrescimento bacteriano pode ser um problema (por exemplo, carnes cruas), são recomendados cloranfenicol (50 mg/L) e clortetraciclina (50 mg/L).
Neste caso, preparar o meio básico conforme descrito acima, com apenas 50 mg de cloranfenicol, verter na quantidade de 100 mL e esterilizar. Preparar também uma solução de 0,1 % (concentração de mássica) de cloridrato de clortetraciclina em água (relativamente instável em solução, deve ser recém-preparada) e esterilizar por filtração. Pouco antes do uso, adicionar 5 mL desta solução assepticamente a 100 mL do meio básico e verter nas placas.
A gentamicina não é recomendada, pois foi relatado que ela causa inibição de algumas espécies de leveduras. Para a amostragem, convém que uma amostra representativa tenha sido enviada ao laboratório. Não convém que tenha sido danificada ou alterada durante o transporte ou armazenamento. A amostra de laboratório não pode ser congelada.
A amostragem não faz parte do método especificado nesta parte da NBR ISO 21527. Convém que a amostragem seja realizada de acordo com a norma específica, apropriada ao produto em questão. Se não houver norma específica, recomenda-se que as partes envolvidas cheguem a um acordo sobre este assunto.
Preparar a amostra de ensaio de acordo com a ISO 6887 (all parts), ABNT NBR ISO 7218, ISO 8261 e a norma específica que trate do produto em questão. Se não houver uma norma internacional específica, recomenda-se que as partes envolvidas cheguem a um acordo sobre este assunto.
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