Pode-se entender os parâmetros gerais para avaliar o desempenho e assegurar a qualidade dos métodos utilizados para a quantificação de sequências específicas de ácidos nucleicos (alvos).
A NBR ISO 20395 de 02/2021 – Biotecnologia – Requisitos para avaliação do desempenho dos métodos de quantificação para sequências-alvo de ácidos nucleicos – qPCR e dPCR fornece os requisitos gerais para avaliar o desempenho e assegurar a qualidade dos métodos utilizados para a quantificação de sequências específicas de ácidos nucleicos (alvos). É aplicável à quantificação de sequências-alvo de DNA (ácido desoxirribonucleico) e de RNA (ácido ribonucleico), utilizando as tecnologias de amplificação por PCR digital (dPCR) ou por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Aplica-se às sequências-alvo presentes em moléculas de ácido nucleico, incluindo DNA de fita dupla (dsDNA), como DNA genômico (gDNA) e DNA plasmidial, DNA de fita simples (ssDNA), DNA complementar (cDNA) e RNA de fita simples (ssRNA), incluindo RNA ribossômico (rRNA), RNA mensageiro (mRNA) e RNA não codificante longo e curto [microRNA (miRNA) e RNA de interferência curtos (siRNA)], bem como RNA de fita dupla (dsRNA).
Aplica-se aos ácidos nucleicos derivados de fontes biológicas, como vírus, células procarióticas e eucarióticas, fluidos biológicos livres de células (por exemplo, plasma ou meio de cultura) ou de fontes in vitro (por exemplo, oligonucleotídeos, construções gênicas sintéticas e RNA transcrito in vitro). Não é aplicável à quantificação de oligonucleotídeos de DNA muito curtos (<50 bases).
Abrange o projeto analítico, incluindo estratégias de quantificação (quantificação do número de cópias de ácidos nucleicos utilizando uma curva de calibração como na PCR ou por meio de contagem molecular como na dPCR, quantificação relativa para uma amostra independente e medições de razão) e uso de controles; a quantificação da concentração mássica total de ácido nucleico e controle da qualidade de uma amostra de ácido nucleico, incluindo a avaliação da qualidade do ácido nucleico (pureza e integridade); o desenho do ensaio da PCR, otimização, testes de especificidade in silico e in vitro; o controle e análise da qualidade dos dados, incluindo critérios de aceitação, estabelecimento de threshold e normalização; a validação de método (precisão, linearidade, limite de quantificação, limite de detecção, exatidão e robustez), com requisitos específicos para qPCR e dPCR; as abordagens para estabelecer a rastreabilidade metrológica e estimar a incerteza de medição.
Este documento não fornece os requisitos ou critérios de aceitação para a amostragem de materiais biológicos ou para o processamento de amostras biológicas (ou seja, coleta, preservação, transporte, armazenamento, tratamento e extração de ácidos nucleicos). Também não fornece os requisitos e critérios de aceitação para aplicações específicas (por exemplo, aplicações em alimentos ou clínica em que problemas específicos da matriz podem surgir).
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Como deve ser feita a determinação da razão entre dois alvos por dPCR?
Por que o método de qPCR ou dPCR deve ter os controles corretos?
Como deve ser feita a quantificação do ácido nucleico total?
Este documento foi desenvolvido para apoiar especificamente os requisitos analíticos com relação à quantificação de sequências específicas de ácidos nucleicos (alvos). Ele também pode beneficiar mais amplamente as indústrias de biofabricação, pesquisa e desenvolvimento em biociência, biotecnologia industrial, bioengenharia e terapêuticas avançadas, que precisem demonstrar a qualidade do produto com base na medição e na quantificação de alvos específicos de ácidos nucleicos.
As figuras abaixo mostram exemplos de amostras de DNA de diferentes qualidades. A amostra de DNA de boa qualidade na primeira figura apresenta razão 260/280 entre 1,8 a 2,0, e razão 260/230 de 2,20. A amostra de DNA de baixa qualidade na outra figura A.2 não mostra um pico definido a 260 nm, além de exibir absorbância a 280 nm e um pico grande de 230 nm, resultando em uma razão 260/230muito baixa (0,33) e uma razão 260/280 <1,8.
A quantificação de sequências específicas de ácidos nucleicos (alvos). Ele também pode beneficiar mais amplamente as indústrias de biofabricação, pesquisa e desenvolvimento em biociência, biotecnologia industrial, bioengenharia e terapêuticas avançadas, que precisem demonstrar a qualidade do produto com base na medição e na quantificação de alvos específicos de ácidos nucleicos.
A quantificação de sequências-alvo de ácidos nucleicos é uma medição transversal fundamental que impacta amplamente muitos aspectos da biotecnologia. Alguns exemplos são a quantificação de biomarcadores de ácido nucleico para monitorar a eficiência de bioprocessos e a conformidade com os parâmetros da qualidade, baseadas no projeto para fabricação biofarmacêutica e de biotecnologia industrial, a caracterização da pureza e da qualidade de células derivadas de produtos medicinais de terapia avançada; a avaliação do número de cópias de genes para avaliar a potência e a eficácia de terapias baseadas em genes e os ensaios de controle de processos para edição de genes e aplicações de bioengenharia.
A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em questão transformou o campo da análise de ácidos nucleicos devido à sua robustez e simplicidade. Os avanços tecnológicos na instrumentação resultaram em uma ampla gama de abordagens/instrumentos de quantificação de ácidos nucleicos baseados em PCR com desenvolvimentos subsequentes, como os exemplos citados a seguir. O PCR quantitativo em tempo real (qPCR), o qual oferece métodos para quantificação de moléculas de DNA e RNA relativos a um material de calibração ou amostra independente, e o PCR digital (dPCR), o qual oferece a capacidade de realizar quantificação rastreável ao SI, por meio do conceito de enumeração molecular, sem a necessidade de uma curva de calibração.
No entanto, a realização de testes de quantificação de ácidos nucleicos com um alto padrão da qualidade analítica pode ser um desafio. Por exemplo, é bem sabido que os extratos de ácidos nucleicos impuros ou degradados podem afetar a exatidão da quantificação. Da mesma forma, um teste qPCR ou dPCR mal projetado, com baixa eficiência de amplificação e de especificidade dos iniciadores terá um impacto na exatidão da quantificação.
Além disso, os aspectos como calibradores, curvas-padrão, normalização e processamento de dados podem ter uma grande influência na exatidão da medição quantitativa dos ácidos nucleicos-alvo. Este documento pretende melhorar a confiança nos dados produzidos, dar suporte aos procedimentos de seleção e otimização, e fornecer parâmetros de desempenho de apoio que possam ser utilizados durante a qualificação de desempenho de um procedimento de medição específico para a quantificação de sequências-alvo de ácidos nucleicos.
Os dados da indústria de biotecnologia e de ciências biológicas com maior confiança na medição permitirão a interoperabilidade de dados, a melhoria da qualidade do produto e a redução de riscos e custos, e facilitarão o comércio internacional. O projeto de um experimento de quantificação de ácidos nucleicos deve incluir a seleção apropriada do tipo e do número de amostras, as etapas do processo de replicação, os controles que convém que sejam incorporados, a necessidade de randomização das amostras e a sua disposição-padrão dentro do experimento.
Os fatores específicos a serem considerados estão discriminados a seguir. Convém que a avaliação da precisão do ensaio, realizada durante a validação do método para a sequência-alvo de ácido nucleico na faixa pretendida da amostra de teste, oriente o número de réplicas de reações durante uma análise de rotina. A curva de calibração deve ser construída utilizando padrões de medição independentes, com concentrações absolutas ou relativas especificadas [por exemplo, concentração do número de cópias (cópias/μL); padrões de razão de massa (g/kg); Sistema Internacional de Unidades (SI)] que possuam a mesma ou matriz similar que as amostras de teste.
A imprecisão da curva de calibração deve refletir a incerteza das medições e se propagar ao estimar a incerteza de medição das concentrações das amostras testadas. Se o RNA for analisado, os padrões de calibração devem conter RNA e serem pré-tratados da mesma maneira que as amostras de teste, isto é, incluindo uma etapa de transcrição reversa. Se for analisado o DNA circular, deve ser linearizado para remover qualquer superenovelamento.
Convém que, se a amostra de teste for DNA de fita simples (ssDNA) (por exemplo, cDNA), os padrões de medição sejam DNA de fita simples, ou convém que se altere a fórmula da curva de calibração para refletir a diferença de Cq de 1 unidade, pois o molde de ssDNA não é amplificado no primeiro ciclo de PCR.
As soluções de calibração devem ser distribuídas uniformemente em toda a faixa de concentração e, de preferência, estender-se além dela. Convém que se utilizem no mínimo cinco concentrações diferentes de cada uma delas em pelo menos em duplicata. A quantificação de ácidos nucleicos por dados de qPCR, com base nos valores de Cq, sem o uso de uma curva de calibração, é frequentemente referida como quantificação relativa.
Como os valores de Cq são uma variável logarítmica, um valor delta Cq expressa essencialmente uma medida de razão entre dois valores de grandeza. Convém que o valor delta Cq primário, calculado em um fluxo de trabalho de análise de dados, seja baseado nos valores Cq de duas amostras medidas em um mesmo ensaio de PCR. Não é recomendado que o cálculo de delta Cq primário seja baseado nos valores de Cq de dois ensaios de PCR para uma mesma amostra, pois os valores de Cq não têm relação entre si, em termos da quantidade do alvo.
Além disso, as propriedades de amplificação e a configuração de threshold de ensaios diferentes de PCR são independentes e tornam a comparação direta irreprodutível. Devido à ausência de uma curva de calibração, a comparação dos dados de vários experimentos requer a inclusão de um calibrador interplacas ou de uma amostra de referência, que é incluída em cada placa, a fim de normalizar as diferenças na configuração do threshold.
Para medições de variação de número de cópias por qPCR em que a amplificação ou a deleção do gene é comparada a um gene de referência, é requerida uma amostra de referência com uma razão conhecida de 1:1 para normalizar possíveis diferenças na eficiência da qPCR entre os dois ensaios de PCR. Além disso, convém que os procedimentos de medição por qPCR que aplicam uma abordagem de quantificação relativa incluam uma amostra de referência adicional independente ou de um material de referência controle em cada placa de qPCR, a fim de monitorar a reprodutibilidade da abordagem de quantificação ao longo do tempo, pois, ao contrário da abordagem com uso de uma curva de calibração, não existe um calibrador com um valor atribuído independentemente e a eficiência da PCR não é medida em cada experimento.
Quando o tratamento estatístico, incluindo o fornecimento de intervalos de confiança ou incerteza de medição expandida, se baseia em uma premissa de distribuição, convém que a premissa relevante seja verificada quanto à validade. Tais verificações podem incluir, por exemplo, um teste estatístico para o desvio de uma suposta distribuição ou inspeção de um gráfico quantil-quantil. Convém que um mínimo de 30 pontos de dados independentes seja gerado para qualquer verificação de suposições de distribuição.
Como exemplo, pode-se fazer uma suposição de normalidade que pode ser verificada utilizando um teste de Shapiro-Wilk ou utilizando um gráfico de probabilidade normal. As verificações das premissas de distribuição não constituem prova de uma distribuição particular. Em vez disso, elas indicam que os desvios da distribuição adotada não são uma questão relevante para o conjunto de dados específico.
Se a análise estatística for realizada com dados transformados em log, convém que os intervalos de confiança e as incertezas da medição sejam relatados na mesma escala. Se os valores transformados em log forem convertidos em uma escala linear, intervalos de confiança ou incertezas de medição assimétricos devem ser calculados ou fornecer evidências de que uma aproximação simétrica do intervalo de confiança na escala linear é suficiente para cobrir o maior dos dois intervalos de confiança assimétricos.
Os métodos de quantificação aplicando normalização devem demonstrar que a estratégia de normalização é apropriada. Convém que a normalização minimize o impacto de variações técnicas, ou ruídos, para facilitar a determinação da verdadeira variação biológica.
Tem sido relatado um viés de amplificação na quantificação de miRNA, baseado em qPCR. Convém que isso seja levado em consideração para a normalização dos resultados de medição de miRNA. A normalização compensa os fatores que influenciam a amostra em geral, em vez de ser específica para o ácido nucleico-alvo e, portanto, evita fontes de variação inespecífica, que confunde a medição do gene de interesse.
Os fatores técnicos que são controlados com uma estratégia de normalização eficaz incluem variabilidade de amostragem, deterioração da amostra durante o transporte e armazenamento, rendimento da extração de ácido nucleico e da transcrição reversa. Embora a normalização seja comumente aplicada aos valores de Cq do qPCR, tanto os valores de Cq quanto os números de cópias podem estar sujeitos à normalização.
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